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引言
作为实验室经典技术之一 ，免疫组织化学法（Immunohistochemistry，IHC）在恶性肿瘤的诊断研究肿瘤细胞类型的鉴定，
预后，感染的诊断，肾脏病理，淋巴病理，预测靶向治疗的使用等方向具有广泛应用，同时也可作为其他实验技术中的辅助研究手段。接下来，
小编便给大家分享本实验技术的详细操作步骤并对实验结果中的常见问题提供可能的解决思路，欢迎大家评论区进行交流，分享经验，共同进步。
01
概念介绍
应用免疫学及组织化学的原理，即通过抗原和抗体之间的结合及呈色反应，对组织切片或细胞标本中的某些成分进行原位的定性、定位或定量的研究。
02
实验步骤
组织标本的制备（以冰冻组织切片为例）
将锡箔纸折为高度约为 1.5 cm 的小篮，作为包埋模具。加入冷冻包埋剂，将取出的新鲜组织完全浸入冷冻包埋剂中；将包埋模具放入盛有少量（仅没过容器底即可）2-甲基丁烷的容器中(作为过渡，可有效防止冰晶的形成)，迅速转移容器至液氮，快冻 1-2 min，随后转移组织，保存于-80℃。冰冻切片机切片，机内温度设置为-22℃，厚度为5-10μm(实验允许范围内尽可能薄，可有效降低组织染色过程的边缘效应或脱片情况)。新鲜切制的切片烘片机70℃烤片2-3h，若是于-80℃冰箱取出的切片则需要放置于通风橱室温晾置1.5-2h，烤片或晾片结束后用双蒸水润洗切片以去除包埋剂，随后使用免疫荧光固定液固定切片10-15min。
抗原修复
切片完全置于抗原修复液，微波炉高火5min加热至沸腾，以暴露抗原位点，随后取出自然冷却至室温，若时间紧张可置于自来水中加速冷却，重复此步骤一次。
注:因加热时会存在蒸发问题，固需随时观察切片情况并对抗原修复液进行及时更换或补充，确保切片完全浸入于修复液中。
阻断
切片放入氧化阻断液(可使用甲醇+3%过氧化氢，以去除内源性过氧化氢酶)中避光阻断30min(至少30min，可根据实际情况适当延长至45min，减少非特异性结合)，结束后使用免疫组化笔圈出组织。
封闭
使用正常动物血清或免疫染色封闭液封闭1-2h，可适当延长时间以减少非特异性结合。
孵育一抗
一抗使用免疫荧光染色一抗稀释液稀释，稀释比例具体可查看一抗说明书，需在合适范围内摸索合适比例(若实验材料珍贵可进行预实验摸索合适浓度，避免浪费)，4℃孵育过夜。
注:抗体滴加前需保证切片已干燥无水分残留，避免因水分残留而导致组织抗体孵育不均匀,最终致使染色不均。
孵育二抗
滴加酶标记二抗(一般无需稀释直接使用,注意使用时核对种属是否正确)，室温孵育45min。
显色
按照说明书推荐的比例配置DAB工作液，吹打混匀后滴加于组织切片进行显色，需注意DAB显色液需现用现配，建议可将玻片放置于白纸上再进行滴加DAB工作液，以便于及时观察组织颜色变化，出现棕黄色反应时及时将玻片放入单蒸水中润洗，随后晾干中性树胶封片，正置显微镜观察并拍照。
03
实验结果常见问题及解决方案
问题可分为三类：阴性结果（即无阳性信号）,非特异性染色（有阳性信号）和着色不均
阴性结果
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可能原因 解决方案 |
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抗体质量存在问题 |
更换高质量、品质有保障的抗体 |
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抗体浓度 |
进行预实验摸索抗体使用浓度 |
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抗原修复不全 |
更换合适的抗原修复方式及修复时间 |
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封闭时间过长 |
减少封闭时间 |
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DAB孵育时间短 |
镜下控制显色时间 |
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细胞通透不充分，抗体未能进入 |
选择合适的通透剂及其反应时间 |
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抗原丰度 |
正常阴性 |
非特异性染色
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可能原因 解决方案 |
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抗体质量存在问题 |
更换高质量、品质有保障的抗体，尽量使用单克隆 抗体 |
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抗体抗体浓度过高或孵育时间过长 |
降低抗体浓度和孵育时间 |
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切片在缓冲液中浸泡过久 |
抗原修复之后及时封闭不可浸泡过夜 |
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存在内源性过氧化物酶及生物素 |
延长灭活时间 |
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封闭时间不足 |
延长封闭时间 |
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DAB孵育时间过久或浓度过高 |
按说明书配置，并及时于镜下观察控制反应时间 |
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抗体孵育后洗涤不充分 |
每次孵育之后洗3*5次 |
着色不均
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可能原因 解决方案 |
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组织切片厚度不均匀 |
切片时更换刀片并重新调整切片机参数 |
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试剂配制时未混匀，浓度不均一 |
试剂充分混匀后进行滴加 |
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试剂未完全覆盖组织 |
滴加试剂时保证试剂可完全覆盖组织 |
04
高质量抗体品牌推荐
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参考文献
[1].Jensen, Ellen C . Quantitative Analysis of Histological Staining and Fluorescence Using ImageJ[J].
The Anatomical Record, 2013, 296(3):378-381.
[2].Varghese F, Bukhari A B, Malhotra R, et al. IHC Profiler: An Open Source Plugin for the Quantitative Evaluation
and Automated Scoring of Immunohistochemistry Images of Human Tissue Samples[J]. Plos One, 2014, 9(5):e96801.
