IP、Co-IP、Pull-down 快速区分

一、概念

（一）免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）

该技术利用抗原与抗体的特异性反应，从不均一的细胞或组织提取物中富集特定蛋白质。在免疫沉淀过程中，利用抗体结合目标蛋白，通过添加Protein A/G磁珠等亲和层析介质来沉淀复合物，利用磁珠的磁性用磁架收集抗原-抗体复合物，通过洗涤去除未结合的物质，获得富集的蛋白。

（二）免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）

该技术的操作过程与前者并无区别。不同之处在于针对富集的蛋白样品，一个样本检测两个或多个蛋白质，从而探究诱饵蛋白的互作蛋白质。因样本来源于生物体的细胞或组织，免疫共沉淀的结果更还原体内蛋白质之间的相互作用。该技术不能证明蛋白质之间的互相作用是直接的还是间接的。比如A诱饵的沉淀样本中检测B蛋白，并不意味着A-B直接结合，存在A-C-F-D-B或A-D-B-F等间接结合的可能性。

（三）Pull-down

该技术是通过体外表达带标签的诱饵蛋白（如GST/His标签），利用标签以及亲和柱的特异性结合，检测与诱饵蛋白互作的其他蛋白质。根据实验设计的不同，可以分为两种类型：

1粗提物Pull-down：重组标签蛋白与细胞/组织裂解液孵育，用于筛选与诱饵蛋白结合的候选互作蛋白。此方案不能区分直接或间接作用。

2纯化蛋白Pull-down：两种蛋白均为重组纯化（如GST-A+His-B），在体外无其他蛋白存在的条件下进行结合实验。若检测到相互作用，则代表两者存在直接结合。

Pull-down实验与Co-IP实验其实是相互补充的两种实验方法，通过二者结合，我们才能更准确地了解两个蛋白之间的真实互作情况。

二、实验流程

（一）IP和co-IP的Protocol

1. 样品制备：

① 配制细胞裂解液：称取150 mM NaCl，50 mM Tris-HCl （PH = 8.0），10 mM MgCl₂，0.5%（v/v）Triton X-100，10%（v/v）甘油，过滤后4℃保存。使用时1:100比例添加适量的

蛋白酶抑制剂（PI）和PMSF。

② 以Jurkat细胞为例，收集细胞并计数，取4 × 10⁷个细胞，1000 rpm室温离心5 min，然后再用预冷的PBS洗涤三遍。

③ 加入2 mL的细胞裂解液（使用前加入PI和PMSF），分装为两个EP管中，每管各1 mL，封口膜封口并放于4℃摇床裂解30 min。裂解完成后，4℃条件下12000 g离心15 min。将上清转移至新的EP管中，最后取80 μL加入适量的5 × loading buffer，最后98℃煮样10 min，作为Input阳性对照。

2. 平衡树脂：

取240 μL的50% protein G sepharose 4B树脂，加入1 mL细胞裂解液洗涤，然后4℃条件下1700 rpm离心4 min，洗涤三遍。最后一次弃去上清并加入120 μL细胞裂解液重悬树脂。

3. 预吸附：

每1 mL的细胞裂解液（步骤2所得的）加入60 μL的50%平衡树脂，放置于4℃水平摇床上摇晃1 h。预吸附结束后，4℃条件下1700 rpm离心4 min，收集上清到另一洁净EP管中。

4. 抗体结合：

① 将细胞裂解液平均分到2个EP管中，每管加入不同的抗体，对照组加入对照的同种非特异性抗体4 ug，实验组加入特异性抗体4 ug，并放置于4℃层析柜中摇动结合过夜。

② 结合过夜后，分别加入60 μL的50%平衡树脂，4℃层析柜摇动3-4 h。

5. 洗涤树脂：

4℃条件下1700 rpm离心4 min，小心去掉上清，使用细胞裂解液重复洗涤三次。洗涤完成后加入等体积2 × loading buffer，并放于98℃煮样5 min，瞬时离心后放-20℃保存。

6. 检测：

Western blot检测，上样之前涡旋震荡后瞬时离心。每组各取5 μL样品用于检测IP下来的蛋白，另外每组各取20 μL样品用于分析免疫共沉淀的蛋白。

7. 结果解析

通常检测如图1所示，该文章通过co-IP验证CDKL3和Akt是否存在相互作用，以Akt抗体富集该Akt蛋白，在③泳道检测出CDKL3与Akt的存在，表明该样本中两个蛋白存在相互作用。

图1 Co-IP免疫印迹结果图^[1]

（二）Pull down的Protocol

1. 质粒构建：

① 利用已知含有特定蛋白的样本cDNA，PCR扩增目的蛋白的DNA片段；

② 通过基因工程技术（酶切、酶连/重组），将该序列重组至合适的表达载体上（以GST标签为例使用pGEX-4T-1质粒）；

③ 将重组质粒转化至Stbl3感受态，过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定、测序分析；

2. 转化：将验证过的pGEX-4T-1-A重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta菌株；

3. 诱导表达：

① 挑取平板上的单个克隆，转移至含Amp抗生素的5 mL LB液体培养基中，37℃摇菌过夜，制备种子液（12-16 h）；

②　将菌液转移至含Amp抗生素的500 mL 的LB锥形瓶中，37℃，250 rpm培养至OD600为0.4-0.6；

③ 加入终浓度为0.1 mM的IPTG，在18℃条件下培养12 h。

4. 破碎菌体：

① 4℃，3800 g离心10 min收集细菌，弃去上清。菌体可以直接纯化或放置于-20℃保存。取出菌体，立刻放置于冰盒上，每50 mL培养基得到的菌体加入6 mL预冷的含1 mM PMSF的裂解液（50 mM Tris-HCl，1% Triton X-100，150 mM NaCl，pH=8.0），吹打混匀；

② 使用漩涡振荡仪振荡悬浮菌液，然后将菌液转移至10 mL的离心管中，每管约6 mL,冰水混合物上低温超声破碎，超声破碎的条件为破5 s，停10 s，总共破碎20次，直至裂解液充分澄清为止；

注：细菌破碎时，应将离心管置于冰水中，避免蛋白质因产热变性。同时，细菌破碎的条件需自行优化。

③ 4℃，10000 g离心10 min，上清转移至另一干净的10 mL离心管中，重复离心一遍，然后上清再转移到另一干净的10 mL离心管中，-80℃保存备用；

5. 纯化：

① 取500 μL GST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用1 mL细胞裂解液润洗三次，将冻融的融合蛋白GST-A与树脂混匀，4℃层析柜旋转结合30 min。500 g低温离心5 min，弃去上清，并加入1 mL的细胞裂解液洗涤三次。

② 同时制备细胞裂解液，裂解液（50 mM Tris-HCl，1% Triton X-100，150 mM NaCl，pH=8.0），按照1:100的比例添加蛋白酶抑制剂PI。

注：大量纯化时，利用低压层析系统，细菌裂解液上清液转移至GST binding buffer预平衡的GST亲和层析柱；用binding buffer冲洗层析柱，至流出液的OD280值到达基线；用GST Elution buffer洗脱目的蛋白，收集流出液；收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用Tris-HCl透析过夜；进行SDS-PAGE电泳，对凝胶进行考马斯亮蓝染色，染色过夜后脱色处理，观察目的蛋白是否大量表达；（详细参考使用的试剂盒说明书资料）

6. 检测：

① 将结合有GST融合蛋白的谷胱甘肽树脂悬浮在缓冲液中，加入含有其他纯化蛋白（FLAG-B）的溶液，同时采用结合有GST空蛋白的谷胱甘肽树脂平行操作作为对照组；

② 4℃旋转结合3h，1800 rpm离心4 min，弃去上清；再加入缓冲液对树脂进行洗涤，重复2-3次；

③　加入适量 loading buffer，98℃煮样5 min；SDS-PAGE以及WB检测B蛋白。

7. 结果解析：

以图2为例，该文章通过GST-ZBED3和GST-PRMT5分别下拉了FLAG-PRMT5与FLAG-ZBED3，表明这两个蛋白存在直接相互作用。

若检测样本类型为细胞裂解液，则结果以图3为例。该结果表明ORP4L与ITPR1（2615-2695）存在相互作用，是否是直接的未知。

图2 GST pull-down免疫印迹结果图^[2]

图3 GST pull-down免疫印迹结果图^[3]

三、常见问题与建议

四、参考文献

[1] He A, Ma L, Huang Y, et al. CDKL3 promotes osteosarcoma progression by activating Akt/PKB. Life Sci Alliance. 2020;3(5):e202000648. Published 2020 Mar 31.

[2] Luo YY, Ruan CS, Zhao FZ, et al. ZBED3 exacerbates hyperglycemia by promoting hepatic gluconeogenesis through CREB signaling. Metabolism. 2025;162:156049.

[3] 李超文. OSW-1 抑制 ORP4L 的功能导致 T-ALL 细胞的死亡[D]. 暨南大学, 2018.