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ELISA速通指南
一、概念
酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay，ELISA）是一种基于免疫反应的高灵敏度检测技术，被广泛应用于生物学、医学等多种领域中对特定分泌蛋白、细胞因子、抗原、抗体含量的测定。该技术的核心原理是通过固相载体（如聚苯乙烯）吸附抗原或抗体，当检测样本中的抗体或抗原结合后，加入酶标二抗以及底物进行显色反应，实现对目标分子的定性或定量分析。
二、ELISA的分类与区别
（一）ELISA的分类
ELISA主要分为四种类型：直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法。
1. 直接法
将抗原直接吸附在固相载体上，加入酶标抗体直接检测抗原。
2. 间接法
抗原包被在固相载体上，先由一抗结合抗原，再用酶标二抗检测一抗。
3. 双抗夹心法
针对由多表位抗原的检测，首先由捕获抗体包被在固相载体，加入样品后抗原抗体结合，再加入生物素标记的检测抗体，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体”复合物，加入链霉亲和素-HRP，与生物素结合，加入底物显色实现检测。
4. 竞争法
样品中的抗原与酶标抗原竞争性结合有限的抗体。标本中抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，显色结果越浅，显色结果与待测抗原的量成反比。
（二）区别
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类型 |
检测目标 |
灵敏度 |
优点 |
范围 |
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直接ELISA |
抗原 |
低 |
操作简单 |
高浓度抗原初筛 |
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间接ELISA |
抗原或抗体 |
中高 |
一抗不被标记， |
病原体抗体检测 |
|
夹心ELISA |
抗原 |
最高 |
高灵敏度、高特异性 |
细胞因子、蛋白质定量 |
|
竞争性ELISA |
抗原或抗体 |
中高 |
适用于小分子检测 |
药物残留、激素分析； |
三、ELISA操作流程
（一）样品的准备和保存
1. 血清
用干净的试管收集血液，凝固30 min后离心1000 g 15 min，收集血清。
2. 血浆
采用肝素或EDTA抗凝管，收集血液后30 min内离心1000 g 15 min。
3. 细胞培养上清
离心去除沉淀。
4. 细胞裂解液
细胞去除培养液（悬浮细胞需先离心收集），PBS洗2遍。加入适量的裂解液，用枪吹打混匀，确保裂解液与细胞充分接触。裂解后，4℃条件下10000 g离心3-5 min，收集上清。
关于保存，上述样品处理好后立即分析或分装-20℃冷冻保存。
（二）实验步骤（以BOSTER货号EK0373双抗夹心法为例）
1. 根据样本量确定使用的孔数，并增加1孔为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；
2. 将1000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.2 pg/mL、15.6 pg/mL的标准品各100 μL依次加入一排7孔，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于检测样本，直接添加已经稀释过的样品100 μL。酶标板加上封板膜，37℃反应90 min。
3. 反应后用自动洗板仪吸去酶标板的液体，甩干并对着吸水纸拍几下。
4. 将准备好的生物素标记的检测抗体工作液按照每孔100 μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。酶标板加上封板膜，37℃反应60 min。
5. 使用1 ×洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1 min，每孔洗液量至少300 μL。
6. 将准备好的ABC工作液（亲和素-过氧化物酶复合物）按每孔100 μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。酶标板加上封板膜，37℃反应30 min。
7. 使用1 ×洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1-2 min，每孔洗液量至少300 μL。
8. 按每孔90 μL依次加入TMB显色液，37℃避光反应25-30 min。
9. 按每孔100 μL依次加入终止液，此时蓝色立刻转变为黄色。
10. 用酶标仪在450 nm测定O.D.值。
11. 根据样品吸光值在坐标上找出相应浓度。样品稀释N倍，其实际浓度 × N倍。
典型数据
供参考，TMB 37℃反应25 min。(不同用户最佳显色时间会有所不同)
|
浓度(pg/mL) |
0 |
15.6 |
31.2 |
62.5 |
125 |
250 |
500 |
1000 |
|
O.D. |
0.004 |
0.084 |
0.141 |
0.247 |
0.512 |
0.893 |
1.519 |
2.361 |
四、ELISA实验常见问题
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常见现象 |
可能的原因 |
解决方案 |
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信号较弱 |
标准品配制不正确 |
标准品加稀释液后充分溶解，并在指定时间内使用 |
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加入孔内的试剂量不足 |
确保枪头与枪插紧或移液器功能正常 |
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抗原抗体反应不充分 |
延长反应时间，在最适温度下进行 |
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试剂储存不当 |
按照说明书要求保存试剂盒 |
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酶标仪滤光片选择不正确 |
如TMB显色使用450nm滤光片 |
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试剂盒平衡不充分 |
确保试剂盒在使用前恢复到室温 |
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显色时间不足 |
增加底物显色的时间 |
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抗体或ABC用量不足 |
检查抗体稀释倍数是否正常 |
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背景高 |
显色时间过长 |
控制显色时间 |
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洗板不充分 |
增加洗涤次数；延长洗涤时间 |
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无信号 |
加试剂顺序出错或漏加 |
实验操作前仔细确认protocol |
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同时操作两个盒子，试剂或板子混用 |
做好标记，区分清楚 |
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标曲佳但样品孔 |
样品中待测物超过标曲范围 |
提高稀释比例 |
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样本含量低或样本中无检测物 |
降低稀释比例 |
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边缘效应 |
孵育温度不均衡 |
校正孵育箱温度 |
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蒸发 |
孵育时使用封板膜或加盖板 |
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酶标板叠放 |
避免叠放 |
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重复性差 |
洗板不彻底 |
检查洗液量、时间、次数正确 |
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孵育温度 |
检查温度是否最佳 |
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孔内试剂未充分混合 |
避免孔干燥，试剂失活 |
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加入孔内的试剂量不相等 |
移液器校正并提高操作技术 |
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加样或试剂时，加在孔壁非包被区 |
加样枪头不要贴壁 |
