“转化、转染、转导”快速识别

做质粒构建叫"转化"，做细胞实验叫"转染"，做病毒包装叫"转导"——这三个"转"字，是分子生物学从原核到真核、从体外到体内的技术阶梯。新手常混淆，本文帮助您快速识别，3分钟建立完整概念。

一、转化

转化是指将质粒DNA或构建的重组质粒转入细菌中的实验。涉及实验，如重组质粒的构建。

（一）重组质粒构建的常规流程

1. 获得目的片段：基于已知含有该基因的细胞样本，提取其RNA，反转录为cDNA片段。在NCBI查询目的基因的mRNA序列，设计引物。利用引物以及cDNA模板，进行聚合酶链式反应PCR，获得目的片段的大量扩增。

2. 根据实验目的，选择合适的质粒载体；

3. 通过酶切以及酶连或重组构建重组质粒；

4. 感受态细胞转化，涂布平板；

5. 挑单菌落进行PCR鉴定；

6. 阳性克隆质粒PCR鉴定与酶切鉴定；

7. 测序确定插入片段序列正确、方向无误、读码框完整且无突变；

（二）质粒构建过程中各种酶的区别

1. 目的片段扩增相关酶

模板是cDNA，要求高保真酶。DNA复制方向是5’-3’方向，Pfu酶还有3’-5’的核酸外切酶活性，可删除复制中的错配碱基。保真性是Taq酶的50倍。

2. 菌落PCR相关酶

通常使用Taq酶即可。

3. 酶切相关酶

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。通常可生成平末端或粘性末端，方便后续的重组与酶连。DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。

4. 连接或重组反应相关酶

DNA连接酶

催化DNA片段之间形成磷酸二酯键，将具有互补粘性末端或平末端的DNA片段共价连接。T4 DNA连接酶最常用，依赖ATP供能，连接效率受末端类型、DNA浓度及温度条件影响。

重组酶

催化DNA分子间特异性重组反应，无需限制性内切酶和连接酶参与。识别特定DNA序列或依赖同源序列配对，实现片段定向整合、交换或多片段无缝组装。常用于Gateway克隆、Gibson Assembly等高效克隆系统。

二、转染

转染是指将外源基因导入哺乳动物细胞的一系列技术。 通过该技术实现目标基因的过表达、敲低/沉默或基因组编辑，以研究基因功能或获得特定细胞表型。根据递送基因的表达寿命分为瞬时转染和稳定转染。

瞬时转染：外源基因不整合至细胞基因组，短期大量表达。

稳定转染：外源基因整合至细胞基因组，随着细胞持续增殖，不丢失该基因。

根据递送基因方式的不同分别分为化学转染法、物理转染法以及生物转染法。而生物转染法以病毒为载体递送基因进入细胞，又称为转导。有时从病毒学角度，病毒转导细胞也称之为感染细胞。

（一）物理法

该法可以将核酸直接递送到细胞质或细胞核中，而无需使用化学载体分子。

1. 电穿孔：在电转染过程中，电脉冲在细胞膜上形成临时微孔，以便核酸等物质通过。这种通用方法可用于所有的细胞类型，适合 DNA、RNA、mRNA、RNP 或蛋白质的转染。相关产品包括Neon NxT 系统。

2. 生物弹道颗粒递送系统：利用弹道装置（即"基因枪"）将包被核酸的微观重金属颗粒（通常为金或钨）以高速射入受体细胞。生物弹道递送可用于瞬转分裂期和非分裂期培养细胞，也可用于体内细胞转染，常用于基因疫苗接种和农业应用。

3. 显微注射基因转移法：显微注射法通过细针将核酸逐个细胞地导入细胞质或细胞核。因此，该方法仅限于离体应用，如制备转基因动物。该方法不适用于需要转染大量细胞的研究。

4. 激光介导基因转移：利用激光脉冲使细胞膜瞬时通透。当激光在膜上诱导形成孔洞时，培养基与细胞质之间的渗透压差促使培养基中的核酸或其他所需物质（离子、小分子、蛋白质、半导体纳米晶体等）进入细胞。激光介导转染的优点包括转染效率高，且可在细胞任意位置打孔。然而，该方法需要昂贵的激光-显微镜系统，且细胞必须贴附于基质上。

（二）化学法

主要包括阳离子脂质体法、阳离子聚合物法、磷酸钙沉淀法等。主要利用正负电荷静电吸附作用实现核酸进入细胞。重要基础：细胞膜带负电荷，原因：细胞膜表面含有大量唾液酸（含游离羧基）——细胞膜表面糖蛋白和糖脂糖链末端最常见的修饰成分。

1. 阳离子聚合物法：阳离子聚合物通过与核酸的磷酸骨架产生静电相互作用，形成稳定的核酸-聚合物复合物。其有效吸附于细胞膜表面，并通过内吞作用进入细胞。该方法可传递DNA、RNA，相关试剂包括PEI、polybrene等。

2. 阳离子脂质体法：阳离子脂质体在溶液中与核酸混合并加入到细胞中。随后，核酸-脂质体复合物被细胞吸收。该方法可传递DNA、RNA、siRNA 或寡核苷酸，相关产品包括Lipofectamine 2000/3000、 Lipofectamine RNAiMAX等。常规步骤：稀释——混匀结合——加入细胞——检测。

3. 磷酸钙沉淀法：将 DNA 与氯化钙在缓冲盐水/磷酸盐溶液中混合，以产生钙-磷酸盐-DNA 共沉淀物，随后将这种共沉淀物分散到培养的细胞上。磷酸钙促进共沉淀物中凝聚的 DNA 与细胞表面结合，而 DNA 通过内吞进入细胞。该方法可传递DNA。

4. 其他（DEAE-右旋糖酐法）：阳离子型DEAE-右旋糖酐分子与带负电荷的核酸骨架紧密结合。所形成的核酸-DEAE-右旋糖酐复合物带有净正电荷，使其能够黏附于细胞膜，并通过内吞作用或由DMSO或甘油诱导的渗透休克进入细胞质。该方法可传递DNA。

三、转导

转导相当于转染的生物学方法。对于不适合脂质体介导转染的细胞类型，通常使用病毒载体进行转染。病毒介导转染也称为转导，这种转染方式可在难以转染的细胞类型中实现蛋白过表达或敲低。在实验室研究中常用慢病毒、腺病毒以及腺病毒相关病毒为基因递送的载体。

（一）慢病毒

慢病毒属于RNA病毒。常用的包装系统是二代三质粒系统，包括骨架质粒 psPAX2 、包膜质粒 pMD2.G或pVSV-G以及含目的基因的转移质粒。

转移质粒需要根据实验需求进行选择，主要包括启动子、标签蛋白、荧光和抗性等元件。例如下方不同需求：

1. 目的基因的过表达通常选择 CMV/EF1a 启动子，目的基因的干扰通常选择U6 启动子；

2. 若需要稳转株筛选，则需携带 PURO/NEO 等抗性筛选基因；

3. 后续需要观察慢病毒感染效率一般需要携带 EGFP/mCherry 等荧光蛋白便于通过显微镜直观监测感染效率；

4. 标签蛋白的选择，如纯化蛋白常使用 His 标签，CO-IP 常使用 Flag/HA/Myc 标签，PULLDOWN 常使用 GST 标签等。

（二）腺相关病毒

腺相关病毒AAV属于DNA病毒。不同于慢病毒，AAV不能整合至细胞基因组中，只可在非分裂细胞中长期表达。AAV是一种单链DNA缺陷型病毒，属于微小病毒科。其基因组DNA小于5kb，无包膜，外形为裸露的二十面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染。其包装实验流程类似上图慢病毒包装的步骤。

（三）慢病毒与腺相关病毒的区别