ELISpot速读

在免疫学研究中，ELISA酶联免疫吸附实验是重要的检测技术。通过抗原-抗体的反应，我们能得到样本中目标蛋白或抗体的浓度与效价。比如T细胞研究，最直观地利用ELISA可以测定特定细胞因子的含量。除了ELISA以外，还有一个功能互补的检测技术是ELISpot酶联免疫斑点技术，这项技术不仅可以呈现细胞分泌特定细胞因子的情况，甚至能够聚焦到单个细胞层面，直观告诉你哪个细胞在分泌细胞因子，灵敏度极高。

一、什么是ELISpot？
ELISpot是一种基于抗原-抗体反应在单个活细胞层面上检测免疫功能的技术，核心表现形式为“一斑点一细胞”。利用该技术可检测细胞分泌细胞因子或抗体的频率。ELISA检测液体样本中的分泌蛋白，其结果呈现的是“平均数”或“整体水平”。ELISpot则可以定位到单个细胞层面，灵敏性高，能从数十万个细胞中"揪"出一个阳性细胞。该技术又兼具操作简便、适用于高通量筛选等特点，可应用于药物筛选、疫苗研究、免疫学基础研究、自身免疫病研究等多种免疫研究领域。

二、ELISpot的原理

类似于ELISA的双抗夹心法，ELISpot的核心原理也是双抗夹心法。利用铺于96孔板的PVDF微膜，预先包被捕获抗体在膜表面；加入细胞与刺激物，培养过夜，待细胞充分分泌相应的细胞因子；加入预冷的去离子水，低压渗透使细胞温和破碎，不影响结合在膜上的细胞因子；再加入生物素化检测抗体，洗涤后添加链霉亲和素修饰的碱性磷酸酶（ALP）或辣根过氧化物酶（HRP）；最后添加酶的相应反应底物，适量时间反应在膜上生成不溶性的有色沉淀斑点，加自来水终止；观察并统计斑点，计算阳性细胞率（斑点数/总细胞数）。

三、结果特点

1. 一个斑点一个细胞。

2. 核晕现象：由于细胞分泌细胞因子或抗体呈弥散状，显色结果一般为圆形、中心致密、边缘逐渐变浅。同时若细胞分泌量过多，一般导致靠近细胞侧斑点颜色较深，整体呈现为“核晕现象”。

3. 斑点直径大小通常不一，呈正态分布。

酶联斑点分析仪检测斑点数，计算阳性细胞率（斑点数/总细胞数）。

四、不同底物的显色结果

从左到右检测底物分别为：TMB、BCIP/NBT-Plus以及AEC

显色结果：

1. TMB（HRP酶）：斑点呈绿色，显色速度快，但斑点随时间可能褪色，建议显色后尽快读取。

2. BCIP/NBT-Plus（ALP酶）：斑点呈蓝紫色，显色稳定，干燥避光保存可长期留存。

3. AEC（HRP酶）：斑点呈红色，灵敏度相对较低，适合特定背景下的观察需求。

五、ELISpot与ELISA、FCM的区别

ELISpot本质上是功能学检测，而非表型检测。它回答的不是细胞表达了多少的细胞因子或抗体，而是在特定的刺激条件下细胞是否发挥出特定的免疫效应。——这是评估细胞真实免疫应答能力不可替代的维度。

六、荧光免疫斑点技术

荧光免疫斑点技术FluoroSpot是ELISpot的升级版，核心区别在于检测抗体上标记的是荧光基团而非酶。不同细胞因子（如IFN-γ、IL-2、TNF-α）用不同颜色的荧光标记，通过专用读板仪的分通道成像，可在一孔中同时检测3-4种细胞因子的分泌。

对于传统的ELISpot，当进行双因子检测时，强信号斑点会掩盖同位置的弱信号斑点，导致双分泌细胞被漏判。FluoroSpot采用双层分析，先分通道独立成像，再通过坐标比对判断共定位，从根本上解决了这一问题。FluoroSpot的优势在于：① 多因子检测：单孔获取更多维度的数据，以单个荧光信号分别读数分析然后融合数据，尤其适合分析多功能T细胞（同时分泌多种因子的细胞）；② 节省样本：对临床珍贵样本（如PBMC）尤为友好；③ 信号更清晰：荧光斑点无扩散，定量更准确。

七、参考文献

[1] Axelsson B. Detection of Cytokine-Secreting Cells by Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot). Methods Mol Biol. 2022;2386:61-79. doi:10.1007/978-1-0716-1771-7_5

[2] Czerkinsky CC, Nilsson LA, Nygren H, Ouchterlony O, Tarkowski A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):109-121. doi:10.1016/0022-1759(83)90308-3

[3] Janetzki S, Rueger M, Dillenbeck T. Stepping up ELISpot: Multi-Level Analysis in FluoroSpot Assays. Cells. 2014;3(4):1102-1115. Published 2014 Nov 27. doi:10.3390/cells3041102