小鼠肠道固有层ILC2的分离、鉴定与分选

一、实验前准备

（一）试剂
Liberase DH/TM：用无菌水配成10 mg/mL储液，-20℃分装保存。
DNase I：用无菌水配成10 mg/mL储液，-20℃分装保存。

含5% FBS的HBSS：5% 热灭活FBS + 1× HBSS + 10 μg/mL酚红。
FACS buffer：2% 热灭活FBS + 1× HBSS + 0.02% NaN₃。

RPMI-1640完全培养基：RPMI-1640 + 10%热灭活FBS + 100 U/mL青霉素-链霉素 + 10 mM HEPES缓冲液 + 1× MEM NEAA + 1 mM丙酮酸钠 + 50 μM 2-巯基乙醇和50 µg/mL硫酸庆大霉素。

PI/PBS溶液：向1× PBS中加入终浓度为0.5 µg/mL的碘化丙啶。
100% Percoll：将9份Percoll Plus + 1份10× HBSS（按体积比），混合均匀。

（二）抗体

封闭：Anti-mouse CD16/32 (2.4G2) purified
谱系阳性抗体：生物素化修饰的CD3ε、CD4、CD8α、CD11c、FcεR1α、NK1.1、CD19、TER119、CD5、F4/80与Gr-1混合抗体。
检测ILC2：APC streptavidin、PECy7 anti-mouse KLRG1、BV421 rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)、PerCPCy5.5 rat anti-mouse CD25、APCCy7 mouse anti-mouse CD45.2、PE rat anti-mouse CD117 (c-Kit)、V500 rat anti-mouse CD90.2 (Thy1.2)、FITC Rat anti-mouse T1/ST2。

二、小肠固有层ILC2s分离

耗材和仪器：可放置磁力搅拌器的37℃恒温培养箱、100 mL锥形瓶、磁力搅拌子（8 × 25 mm, 8 × 40 mm）。

（一）组织处理与上皮去除
1.1 处死小鼠：颈椎脱臼，70%乙醇消毒皮肤。
1.2 取出小肠：剪开腹腔，从胃幽门至回盲部取出小肠，去除肠系膜及胰腺。
1.3 清除内容物：将小肠置于含3 mL 5% FBS HBSS的6 cm培养皿，冰上。用剪刀柄轻轻压出粪便，并切除派氏结（Peyer's patches，C57BL/6约6–8个）。
1.4 纵向剖开：沿肠系膜附着线纵向剪开，用Kimwipe轻拭去除残余粪便。
1.5 剪成小段：将肠段切成7–8 cm等长小段。
1.6 洗涤：将肠片段移至含7 mL PBS的10 cm培养皿，用镊子vigorously摇晃30–60 s，洗去残留的粪便与黏液，换新鲜PBS重复洗涤3次，直至液体澄清（炎症样本需增加洗涤次数）。
1.7 去除上皮与肠上皮内淋巴细胞：将肠片段切成1 cm左右的片段，转入含40 mL 1 mM EDTA-PBS 的100 mL锥形瓶（预温至37℃）。

1.8 加入8 × 40 mm磁力搅拌子，在磁力搅拌器上37℃搅拌（约500 g）20 min，以去除IEL和IEC。用镊子将肠片段转移至含20 mL PBS的50 mL离心管，手动vigorously摇晃20 s，换新鲜PBS再洗一次。

注意：弃去白色坏死组织（正常为粉红色），保留粉红色小肠片段。

（二）固有层消化
2.1 剪碎：将肠片段移至20 mL锥形瓶，用手术剪剪成 1–2 mm小块。
2.2 第一次消化：加入10 mL预热的2% FBS RPMI + Liberase DH (20 μg/mL) + DNase I (50 μg/mL)。放入8 × 25 mm 搅拌子，37℃搅拌30 min（约500 g）。
2.3 收集上清：将瓶倾斜静置 1 min，转移7 mL上清至15 mL管，冰上保存。
2.4 二次消化：剩余3 mL悬液中，用2.5 mL注射器配18G针头反复抽吸进一步破碎组织。再加入7 mL预热的 2% FBS RPMI + Liberase DH (20 μg/mL) + DNase I (50 μg/mL)消化液，37℃搅拌30 min（约500 g）。
2.5 过滤：将第一次（7 mL）和第二次（10 mL）消化液合并，经70 μm滤网过滤至50 mL离心管。用1 mL注射器轻轻研磨滤网上残留物，并用小体积（3 mL左右）5% FBS HBSS冲洗滤网至终体积50 mL。
2.6 将上述溶液500 g，4℃，离心5 min。弃上清，保留约3 mL液体。
2.7 二次过滤：重悬，将液体经37 μm尼龙滤网过滤至新的15 mL管，再反复用2 mL的5% FBS HBSS冲洗滤网至终体积15 mL，500 g，4℃，离心5 min。

（三）单只小鼠的样本制备

吸弃上清液。

（四）多只小鼠的样本制备

4.1 吸弃上清液。向每支离心管中加入3 mL 100% Percoll，然后用手vigorously摇晃离心管，确保充分混合。500 g，25℃，离心20 min，关闭加速与减速。

4.2 吸弃上清液。用含5% FBS的HBSS将多支离心管中的细胞沉淀合并到一支15 mL离心管中（总体积不超过15 mL），然后500 g，4℃，离心5 min。

4.3 吸弃上清液。

三、流式细胞术鉴定ILC2（单只小鼠）

1. 封闭与染色：用50 μL含anti-CD16/32（2.4G2，1:200）和生物素化的谱系抗体混合物（CD3ε, CD4, CD8α, CD11c, FcεR1α, NK1.1, CD19, TER119, CD5, F4/80, Gr-1，各按推荐稀释度）的FACS buffer重悬细胞沉淀，冰上20 min。

2. 用FACS buffer洗涤一次，500 g，4℃，离心5 min。

3. 用50 μL含CD45.2 APCCy7，KLRG1 PECy7，Ly-6A/E BV421，CD117 PE，CD90.2 V500，CD25 PerCPCy5.5，T1/ST2 FITC与APC标记的链霉亲和素的FACS buffer重悬细胞沉淀。4℃，避光孵育20 min。

注意：如果仪器设备有限可以只染KLRG1与Sca-1两个指标。

4. 用FACS buffer洗涤一次，500 g，4℃，离心5 min。

5. 重悬于100 μL的FACS buffer中，将细胞悬液通过带有滤膜盖的圆底流式管过滤。

6. 上机前加100 μL的PI (0.5 μg/mL) 死活染料。
结果：ILC2为CD45⁺Lin^-KLRG1⁺Sca-1⁺

四、流式分选ILC2（10只小鼠）

1. 将500 μL的1640完全培养基加入1.5 mL无菌微量离心管，置于细胞旋转混合仪上，以约30 rpm旋转至少1小时。

2. 将经全自动磁性细胞分选仪分出的未标记细胞重悬于FACS buffer中，其中含有FITC标记的Sca-1、PE标记的KLRG1以及APC标记的链霉亲和素。（后者用于染色剩余Lin⁺细胞。）

3. 4℃避光孵育20 min。用FACS buffer洗涤一次，500 g，4℃，离心5 min。

4. 重悬于300 μL的FACS buffer中，上机前低温避光保存。

5. 将步骤1中预处理的微量离心管（已含500 μL的1640完全培养基）放置于分选仪的适当位置。

6. 将细胞悬液通过带有滤膜盖的圆底流式管过滤，加入100 μL的PI染色，便于排除死细胞。
结果：ILC2为Lin^-Sca-1⁺KLRG1

五、参考文献

[1] Moro K, Ealey KN, Kabata H, Koyasu S. Isolation and analysis of group 2 innate lymphoid cells in mice. Nat Protoc. 2015;10(5):792-806.